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10.用高效液相色谱法确定未知样中的成分一． 1．实验目的：学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 2．学习用高效液相色谱法确定未知样中的组分，掌握采用高效液相色谱法对物质进行定性分析。二．实验原理：液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来：在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系数K：  K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流动相中的浓度）  显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短，当组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从而达到分离的目的。  一般情况下，当外界条件及方法确定，溶质流经色谱柱时，不同分配系数的物质流出色谱柱的时间不一致，在检测器上得到响应，表现为出峰时间不一致，同一组分（K值固定），保留时间To一致，根据这个特性，可以分离不同的有机化合物。当外界条件及方法确定测量各峰的峰面积 A，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。液相色谱仪工作原理图三．仪器和试剂： 1．高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．流动相： 80%甲醇+20%的水，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。 6．未知样品（含有苯，甲苯），10毫升 7．苯，甲苯的标准溶液，各50毫升 8. 0.45µm的虑膜。四．实验步骤： 1．流动相的准备： 80%甲醇+20%的纯水或去离子水,制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。 2．苯，甲苯的标准溶液：取2毫升的苯，1毫升甲苯的标准液，与已经配置好的流动相混溶，不得有分层或沉淀，脱气后备用。 3．打开仪器，启动泵，打开检测器，同时设定方法（设置泵的流速为4ml/min，柱温为室温（20度左右），停止时间为5 min，当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基线稳定后，仪器自检完毕）。 4．将进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升的苯的标准溶液（比进样阀上的定量环多5-10微升以上?），注入进样阀中。 5．将进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站开始记录并出图11，清洗针管，待用。 6．待基线稳定后，将进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升的甲苯的标准溶液（比进样阀上的定量环多5-10微升以上），注入进样阀中。 7．将进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站开始记录并出图12，清洗针管，待用。 8．基线稳定后，取未知样25微升，进样，出色谱图13。  五．数据分析  1．在标准样品色谱图中标注苯和甲苯保留时间To或保留距离Vo。  2．

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