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Curso Espectrometría de masas,
Electrospray Trampa Iónica y
Maldi-Tof
UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA
Alberto Jorge García
Laboratorio de Proteómica
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa
Universidad Autónoma de Madrid-CSIC
Oferta del Servicio de
Proteómica
• www2.cbm.uam.es/proteomica
• Análisis mediante Espectrometría de
Masas
• Identificación sistemática de proteínas
presentes en las bases de datos a partir de
geles
• La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente
Identificación
Proteína
Proteómica:
Proteoma
Péptidos
BASE DE
DATOS
Fragmentos
BASE DE
DATOS
Proteína
Identificación
Péptido
Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:
• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT
• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante
TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos
determinados: Monitorización de iones sencillos
(SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó
confirmación mediante predicción teórica de
fragmentación
Requisitos para la preparación de
geles
• Reactivos
• Manipulación
– Frescos, alto grado de pureza.
– Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio
– Precauciones en la preparación de la muestra
• Confección del gel
– Lo más cercano posible a la entrega de la muestra
– STD no preteñidos, no coloreados, no
recombinantes. En cantidades conocidas y MW
conocidos
– No admitimos bandas ó spot recortados. Gel
completo
Requisitos para la preparación de
geles
• Diseño del gel (monodimensional). Usuario
– Minimizar el tamaño del carril para mejorar la
razón proteína:gel
– Optimizar la resolución y enriquecer para muestras
muy complejas
• Geles 2 D (bidimensionales)
– Incluido en la oferta de Servicio
– Es crítica la preparación de la muestra por parte del
usuario (Precipitación con acetona)
Tinción de geles
• Tinción Coomassie
–
–
–
–
–
Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco
Coomassie Coloidal, mayor contraste
No fijar con etanol, se forma acetato de etilo
Sensibilidad: 0.1 mg, Cuantitativo
Prácticamente nunca interfiere con la digestión
• Tinción con plata (no recomendada)
–
–
–
–
Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa
Alta variedad en los protocolos de tinción
Interfiere con la digestión
Aumenta la necesidad de concentración de proteína,
bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes
Tinción de geles
• Tinción fluorescente (mono ó 2 D)
– Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata
– Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO
Orange, SYPRO Red, Deep Purple…)
– No interfiere con la digestión
– La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y
recortar las bandas en un transiluminador UV (300
nm)
– Disponible en el Servicio
Digestión “in situ” de geles
• Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con
variaciones entre coomassie y plata.
• Control interno de cada gel digiriendo std de
pm (descarta problemas atribuibles a la
preparación/tinción del gel)
• Control externo con bandas/spots de geles ya
procesados (descarta problemas atribuibles al
proceso de digestión y preparación de muestra
para MS)
Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:
• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT
• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante
TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos
determinados: Monitorización de iones sencillos
(SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó
confirmación mediante predicción teórica de
fragmentación
Espectro de masas MALDI-TOF
Resultados búsqueda en Mascot
Asignación de péptidos en el mapa de MALDI
Aspecto de un mapa cuando no hay digestión
Las masas provienen de queratinas y autoproteolisis
de tripsina
Mapa típico de digestión de queratinas
Contaminación por queratinas
dentro del gel
Sypro Rubi vs Plata
STD PM
Picomoles
2
1
0.5 0.25 0.1
Gel plata
2
1
0.5 0.25 0.1
Gel Sypro
2
1
0.5 0.25 0.1
Gel Sypro
después de cortar
Sypro Rubi vs Plata
STD 45 kDa 2 picomoles (88 ng)
a . i.
17 péptidos
Sypro
1 0 0 0 0
Péptidos de
Ovalbúmina
8 0 0 0
6 0 0 0
4 0 0 0
T
2 0 0 0
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
a . i.
2 5 0 0
8 péptidos
Plata
T
2 0 0 0
T
1 5 0 0
1 0 0 0
5 0 0
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
Sypro Rubi vs Plata
STD 45 kDa 500 fmoles (22ng)
a . i.
T
Sypro
4 5 0 0
10 péptidos
4 0 0 0
Péptidos de
Ovalbúmina
3 5 0 0
3 0 0 0
M
2 5 0 0
2 0 0 0
1 5 0 0
T
1 0 0 0
T
5 0 0
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
a . i.
Plata
3 5 0 0
2 péptidos
3 0 0 0
2 5 0 0
T
2 0 0 0
1 5 0 0
1 0 0 0
T
T
5 0 0
?
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
Sypro Rubi vs Plata
STD 45 kDa 250 fmoles (11 ng)
a . i.
11 péptidos
Sypro
2 5 0 0
Péptidos de
Ovalbúmina
2 0 0 0
T
1 5 0 0
T
1 0 0 0
M
T
5 0 0
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
a . i.
T
Plata
3 péptidos
2 5 0 0
2 0 0 0
M
1 5 0 0
1 0 0 0
T
5 0 0
T
0
1 2 0 0
1 7 0 0
2 2 0 0
2 7 0 0
m /z
Identificación mediante PMF
• Tres niveles de preparación de muestras:
– Sensibilidad normal: método estándar en
placa de acero inoxidable (automatizable)
– Alta sensibilidad: método “anchorchip” con
matriz HCCA y cristalización homogénea de
Bruker (automatizable)
– Muy alta sensibilidad: método “anchorchip”
con matriz DHB y cristalización heterogénea
(no automatizable) Siempre trabajamos con
este método
Identificación mediante PMF
• Métodos de calibración:
– Externa próxima, para búsquedas en DB con 100150 ppm. Los espectros se adquieren con esta
calibración
– Mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas
con 50-100 ppm. Se aplica a la lista de masas
obtenida por calibración externa
– Interna de forma manual, mediante macro ó
software (*) para búsquedas con 30-50 ppm
• Motores de búsqueda:
– Internet (Mascot, Profound)
* Campillo, Martín and Vázquez
Identificación mediante PMF
Causas por las que no se identifica una
proteína
•
•
•
•
•
Mapa con un nº insuficiente de péptidos
Mezcla de proteínas
Proteína no presente en DB
Alto nivel de contaminación
Modo en el que se genera la lista de masas
Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:
• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT
• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante
TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos
determinados: Monitorización de iones sencillos
(SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó
confirmación mediante predicción teórica de
fragmentación
Identificación de péptidos
presentes en DB mediante LCMS/MS ESI-IT
• Alta sensibilidad en modo “full scan”:
Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un
digerido en solución de estándar de BSA
• Muy alta sensibilidad en modo SIM:
“Monitorización de iones sencillos”, 1-10 fmoles
para estándar de BSA
Exclusión Dinámica (Triple-play)
RT: 0.00 - 70.06
NL:
7.13E7
Bas e Peak
F:
MS
040604JAA
s turias EDp
10
11.70
100
95
90
42.33
85
80
75
70
44.62
65
60
12.29
55
12.38
50
14.30
45
14.48
44.81
40
37.41
35.74
35
44.92
30
38.02
14.66
35.06
25
41.15
14.85
20
54.58
54.45
54.67
45.23
39.58
55.39
15
45.34
10.99
10
45.70
8.70
0.90
4.96
1.01
15.29
8.55
55.52
56.03
52.74
15.06
5
53.24
17.50
24.81
24.33
23.66
31.46
25.20
27.77
33.04
52.24
51.99
46.28
56.88
58.40
68.45
67.87
60.26
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tim e (m in)
40
45
50
55
60
65
70
040604JAAsturiasEDp10 #1051 RT: 40.93 AV: 1 NL: 3.14E6
T: + c Full ms [ 400.00-1600.00]
824.60
100
947.46
95
90
85
80
040604JAAsturiasEDp10 #1053 RT: 40.99 AV: 1 NL: 1.07E6
T: + c d Full ms2 [email protected] [ 250.00-1905.00]
754.41
100
75
948.37
70
95
65
040604JAAsturiasEDp10 #1052 RT: 40.97 AV: 1 NL: 1.07E5
T: + p d Z ms [ 943.00-953.00]
60
1198.26
90
947.44
100
905.05
55
85
95
80
50
1197.40
45
40
90
799.00
474.52
947.89
85
1140.74
971.94
35
80
65
948.40
454.22
1112.32
1209.36
1210.23
1217.06 1298.31
1320.08
864.44
1052.50
20
700.28
15
550.76 631.30
Relative Abundance
1022.26
60
947.37
75
825.30
701.64
25
721.41
767.14
1329.11
1403.03
649.04
70
1422.01
475.40
65
1431.67 1512.50
1478.93
1581.58
600
700
800
900
1000
m/z
1100
1200
1300
1400
1500
Relative Abundance
500
50
45
40
1532.65
5
55
60
10
0
400
1507.39
811.09
70
1199.24
632.47
30
75
947.91
55
35
50
30
1600
1508.49
1121.28
45
25
948.46
40
20
617.82
745.43
948.86
948.91
949.43
25
5
946.96
949.82
950.36
946.72
945.72
10
300
952.63
944.66
944.10
950.25
946.43
945.31
950.71
952.20
951.09
951.61
946.21
5
952.81
0
944
945
946
947
948
m/z
949
950
1489.65
1379.13
674.21
483.98
561.15
1104.19
898.29
975.13
404.43
1027.34
1228.22
1180.22
1361.29
1292.66
1537.62 1621.17
1745.60
0
951.37
943.64
943.18
273.91
359.09
387.04
281.92
20
1234.33
868.20
10
30
15
1122.40
15
35
951
952
953
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos
704.5
100
90
736.3
100
A
80
80
Intensidad Relativa
Intensidad Relativa
90
70
60
50
40
30
655.3
20
10
817.3
1082.7
0
600
700
800
900
m/z
1000
1100
70
D
60
S
L
G G V
50
F
40
30
851.3
394.3
1177.3
295.2
10
463.5
1021.3
964.3
764.3
589.5
400
MF
600
800
V
1325.0
80
736.7
B
70
C
90
80
70
z = +2
M = 1470.6
60
50
50
40
30
30
737.2
z = +2
M = 1308.4
60
40
20
655.6
656.2
20
10
Intensidad Relativa
90
Q
P
736
737 738
m/z
739
655 656
m/z
657 658
E
I
L
Y
V
DY
543.2
767.1
769.2
20
654
N
40
0
735
1400
60
429.1
10
0
m/z
1200
YDVYLINPQGK
80
655.2
100
1000
656.1
100
736.3
M
1078.3
20
1200
W
0
100
D
MFVGGLSWDTSKK
932.2
881.2
541.0
204.0 279.0333.1378.0
1031.1 1106.1
0
200
YD
300
V
400
500
Y
600
700
L
I
800
N
900
1000
PQ
1100
1200
1300
m/z
1400
Análisis mediante
Espectrometría de Masas
• Análisis empleando MALDI-TOF
– Muestras preparadas por usuario (incluye
portas y matriz)
– Muestras preparadas por el Servicio
• Análisis empleando LC-ESI-IT de
fracciones de péptidos provenientes de
HPLC preparadas por usuario
Equipos disponibles
• Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo
Autoflex de Bruker, equipado con reflector
• Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo
LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con
sistemas de ionización de nanospray y microspray de
fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100
con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04
por un año)
• Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LCESI-IT y columna RP de 180 mm, flujos de 1,5 a 2 ml/m
Procedimiento de trabajo
• Recepción y control de muestras
–
–
–
–
Aviso previo a la entrega de geles
Escaneo del gel,
Confección de ficha de usuario,
Instrucciones del trabajo a realizar
• Análisis
– Digestión manual en gel
– Obtención del mapa peptídico mediante MALDITOF
– Análisis mediante LC-ESI-IT
Personal del Servicio de
Proteómica
•
Rosana Rogado:
–
•
Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de
Investigación y Laboratorio
Alberto Jorge:
–
•
Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y
Laboratorio
Yolanda Núñez:
–
•
Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio
Anabel Marina:
–
Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2