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生物技術 教師:林維莉 第01週：緒論 第02週：生物技術範疇與發展 第03週：生物科產業常用微生物種介紹 第04週：分子生物技術原理與基本應用(一) 第05週：分子生物技術原理與基本應用(二) 第06週：生物科技於刑事科學上的應用：DNA鑑定與微量物證鑑定 第07週：生物科技於醫學上的應用：疫苗開發與製程 第08週：生物科技於醫學上的應用：病原微生物快速檢驗試劑開發與應用 第09週：期中考 第10週：生物科技於醫學上的應用：生物製劑與基因重組藥品開發與應用 第11週：生物科技於醫學上的應用：癌症及藥物治療發展 第12週：生物科技於生殖醫學上的應用：不孕症治療、臍帶血與幹細胞 第13週：生物科技於醫學美容上的應用 第14週：基因轉殖動物發展與應用 第15週：基因改造食品發展與應用 第16週：小組討論 第17週：小組討論 第18週：期末考 分子生物技術原理與基本應用(二) PCR Biochip Norten, Southen, Westen blotting ELISA IFA PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION) 利用PCR方法可以人工合成一段特定基因的DNA片 段，其原理完全仿照自然界 DNA 合成的步驟，並加 以自動化。基本上，這個技術主要包含三個步驟： DNA 分開(denaturation) 引子煉合及引子廷伸作用。 A.DNA 分開：利用高溫加熱而將雙股 DNA分開。 當溫度降低，二股DNA便有機會再結合在一起。 B. 引子的煉合：引子是經由 DNA 合成儀合成的， 其序列是對應互補於欲進行放大之 DNA片段的序列 。通常 PCR 技術所用的引子均為一對寡核甘酸小片 段，每個引子各自與一股 DNA 互補。當進行煉合時 ，藉著溫度的降低，二個引子各自互補性地結合至其 單股的 DNA 模板上。 C. 引子廷伸作用：第三步就是藉著 DNA聚合脢進行 合成。由引子處，開始由 5‘向3’ 方向，將 dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 依照模板上的序列， 以其互補的核甘酸，逐一接上去，合成了一條新的雙 股 DNA。其中引子自己亦包含在新合成的 DNA片 段上。 PCR機器與結果 PCR機器與結果 引子 ( PRIMERS )設計 引子 ( primers )設計引子時要注意的事項有: (1) 引子長度通常為 18 – 25 個鹼基長。 (2) GC含量約在 40 – 60 %。 (3) 同一反應中的引子序列不可互補，以免造成自相 黏合的情況。 (4) 引子黏合溫度盡量不要相差 5 ℃以上。 (5) 注意模板中所有可能和引子互補的區域，設計時 避免含有這些區域。 (6) 如果引子變性了，則至少在 3’ 端有 3 個鹼基以 上存在才可能使反應進行。 PCR溫度循環設定 1. 起始高溫分離兩股 DNA，溫度應設定在 95 ℃，時間 在5分鐘。時間可隨著 GC 在模版上的比例調升至10分鐘 。 2. 高溫分離兩股 DNA通常 94-95℃進行1~2分鐘即可將 兩股 DNA 分離，如果 GC 含量過高，可將時間提高至 3~4分鐘。 3. Primer黏合，通常 primer 與模版 DNA 黏合的溫度 大約是 『Tm 減 5℃』1~2分鐘。 4. 延展，約在70~75 ℃。Taq DNA polymerase 合成速 率每分鐘合成 2 kb 左右。若 DNA 過大，合成速率約每 分鐘合成 1 kb 左右。 5. 循環次數，一般在25~35次循環就足夠了 6. 最後延展步驟，循環結束後，樣本通常會在 70 – 75 ℃ 延展5~15分鐘，用意在於填補最後幾次循環的產物。 探索基因的功能及其間的交互作用，是為後染色體組 世紀的最重要工作之一，也是從事分子生物及遺傳學 研究的基礎。近年來基因晶片技術的崛起，不僅提供 了解決上述基因研究上的問題，也帶動了全球基因功 能分析自動化的風潮，加速了功能基因研究的進度。 主宰生長、發育、自動調節 (homeostasis)、行為及 疾病的發生等錯綜複雜、迂迴曲折的現象，大大地受 同源的基因所編譯之核醣核酸及蛋白質所支配，也受 到基因的複雜性及基因與周遭環境動態的交互反應所 主宰。 蛋白質染色分析 蛋白質染色分析 基因晶片 微陣列系統 操作流程 酵素免疫分析法 Enzyme-linked immunosorbent assay(簡稱 ELISA）利用抗原-抗體之間專一性鍵結之特性，對 檢體進行檢測；配合酵素呈色反應，即可顯示特定抗 原或抗體是否存在，並可利用呈色之深淺進行定量分 析。 根據待測樣品與鍵結機制的不同，ELISA可設計出 各種不同類型的檢測方式，主要以三明治法（ sandwich）、間接法（indirect）、以及競爭法（ Competitive）三種為主，以下為各種方法之介紹。 間接法常用於檢測抗體，一般將抗原固定在盤底 三明治法 三明治法常用於檢測大分子抗原，將抗體固定於盤底 ，再加入撿體反應在加 上競爭性抗原及呈色 競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用 於檢測小分子抗原 將具有專一性之抗體固定於盤底，加入待測檢體，使 檢體中的待測抗原與抗體進行專一性鍵結。 再加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與盤底的抗體進 行專一性鍵結；由於盤底的抗體有限，因此當檢體中 抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可鍵結的固著抗體 就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵 結，即所謂競爭法之由來。洗去檢體與帶有酵素之抗 原，加入酵素受質使酵素呈色，當檢體中抗原量越多 ，代表塑膠孔盤內留下之帶有酵素的抗原越少，顯色 也就越淺。 腸病毒檢測晶片 腸病毒並非一種病毒，而是一群病毒的總稱。由於這些病 毒都可經由腸道感染，因此統稱為「腸病毒」。「腸病毒 」又可分為五大亞族群： 小兒麻痺病毒 (Polioviruses)：type 1 ~3。 柯沙奇病毒 A 型 (Coxsackieviruses type A)：A1 ~ A22 、A24。 柯沙奇病毒 B 型 (Coxsackieviruses type B)：B1 ~ B6 。 伊科病毒 (Echoviruses)：第1 ~ 33型 (第 10、第 28 型除 外)。 腸病毒：68 ~ 71 型。 它們所引起的症狀略有不同，但也有許多相同處，例如手 口足病及泡疹性咽頰炎等。其他病毒感染也常有類似症狀 。 症狀或疾病 手口足症狀 氣管咽喉炎、肺 炎 心肌炎 腦炎 無菌性腦膜炎 經常感染的腸病 毒 柯沙奇 A、B 型、 腸病毒 71 型 柯沙奇 A、B 型、 ECHO 病毒 柯沙奇 B 型 柯沙奇 B 型、腸 病毒 71 型、 ECHO 病毒 柯沙奇 B 型、 ECHO 病毒 腸病毒的潛伏期約 5 ~ 6 天，通常年齡愈大及 抵抗力愈好的人發生的 症狀愈輕微。許多人是 無症狀感染或是類似感 冒的發燒而已，年幼的 孩童則常出現高 燒、腹 瀉、嘔吐、口腔出現水 泡潰爛、手腳及臀部也 會出現水泡及紅疹等， 因此常被戲稱為「兒童 之口蹄疫」。病情常進 展得快速而猛烈，需一 星期至十天才能復原。 腸病毒檢測晶片 生醫晶片 即時多功可攜式定點診斷用儀器（Vsensor）」，可 利用電學檢測出包含子宮頸癌、腸病毒、肝癌與肺癌 等，比過去光學檢測更精確也更快速， udn健康醫藥 http://mag.udn.com/mag/life/storypage.jsp?f_ART_ID=297546#ixzz29L1EPSJI 免疫螢光染色技術 螢光抗體法 (Fluorescent Antibody Technique) 為 應用組織化學及免疫學的方法，在螢光色素物質結合 抗體的幫助下，使特異的抗原抗體複合物 (AntigenAntibody Complex) 顯現在組織切片或細胞塗抹片 ，因此本法主要靠螢光色素及紫外光源。螢光色素是 一種以紫外線激發照射而放出更長波長的物質。當一 種物質被激發而發光叫做螢 光。如果能源被切斷仍 繼續發光，叫做燐光 (Phosphorescence)。螢光物質 能標附或結合於抗體球蛋白而不干擾其免疫學上的特 異性及其結合抗體的能力。 免疫化學染色(IMMUNOFLUORESCENCE CHEMISTRY ,IHC) 免疫螢光染色分析 (IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY,IFA) 免疫螢光染色技術-流式細胞儀 血清學檢驗 第06週：生物科技於刑事科學上的應用：DNA鑑定 與微量物證鑑定