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电泳技术
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷
相反的电极移动的过程。
 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好
 3 电泳方法分类
按电场分：常压（<500V，适用大分子）、高
压（>500V，适用小分子）
支持体分：自由电泳、区带电泳
仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区
带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
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一 电泳的基本原理
电泳分离：
 移动方向：带电性质决定
 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速
度。
μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt
 影响μ的因素：
 1颗粒本身：带电、大小、形状
 2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电
渗、缓冲液粘度及温度等。
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二 纸电泳
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以滤纸为支持体的电泳技术
操作要点：
1 选择缓冲液
对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影
响
A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液
（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸
pH7.4)
B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋
酸，pH5.9
C 分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸
pH2~3
D 分离糖类：HAC-NaAC, pH3~5
2 滤纸的选择与处理
 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场
强度。
 3 点样
点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样
品）、点一边（已知样品）
干法、湿法
 4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间
 5 显色及分析
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B
Aa：茚三酮、靛红
核酸：紫外光下观察
 一般洗脱定量
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三 薄膜电泳
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支持体：薄膜
优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、
易于定量、便于保存
广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
操作
1 薄膜的处理与放置
2 点样
平衡
3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h
4 显色
四 薄层电泳
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将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行
电泳。
常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等
操作：
1 缓冲液选择
离子强度较高的缓冲液
2 支持物处理
精制品
3 薄层板制作
4加样：挖沟、混合样品、填埋
5 电泳
6分析：印染法
五 凝胶电泳
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支持物：多孔凝胶
聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等
具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高
最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用
和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳
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1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺
（交联剂）→（催化剂） →聚合
催化剂：
（1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）
（2）核黄素（VitB2）＋光
改变单体浓度可改变凝胶孔径
交联剂对孔径有影响：5％最小
根据要分离物质的相对分子质量选择合适
的单体浓度。
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2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝
胶，用不同pH值的缓冲液：
样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓
冲液
浓缩胶：与样品胶相同
分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓
冲液
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样品压缩成层原理：
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电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸
HCl→ (解离） →Cl － ， Cl －泳动速度最快（快离子）
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢
离子）
蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间
电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子
浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加
速移动→P压缩成层
样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测），
CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P
在均一的电位梯度和pH条件下分离
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SDS-凝胶电泳原理
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聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移
率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键
还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P
分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，
形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于
P分子量。
分离测定：
测分子量（与标准蛋白比较）
鉴定样品纯度（条带数目）
测定样品P含量：扫描定量（比色）
凝胶电泳的操作要点
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1 凝胶制备
2 电极缓冲液
3 样品处理及加样
4 电泳
5 染色与固定
6 脱色
7 分析
烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化
六 等电点聚焦电泳
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电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流
电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴
极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移
动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不
同等电点的P得以分离。
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自
由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解
或发生变性的P。
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1 稳定的pH梯度的形成
2 两性电解质载体
要求：
由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH
范围的商品两性电解质载体）
3 支持pH梯度的介质
密度梯度溶液（用于自由电泳）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）
4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳
检测
两性电解质载体的除去
电泳技术思考题
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1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电
泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
5 不连续电泳样品压缩成层原理。
6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何
测定蛋白质等电点？