Transcript L’interférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie

L’interférence ARN
une nouvelle approche pour inhiber
l'expression des gènes.
Perspectives en cancérologie
[email protected]
INSERM EMI 104
CEA Grenoble
Comparaison entre différentes méthodes d’inhibition de gènes.
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Méthodes
Avantages
Inconvénients
---------------------------------------------------------------------Knock-out animal
Inhibition Complète du gène Laborieux, cher, Des
mutants létaux peuvent
empêcher le développement
embryonnaire
Petites molécules
inhibitrices
introduction facile
Anti-sense DNA
Facile
peu onéreux
RNA interference
Spécifique
Relativement facile
Spécificité variable
Travail de développement
intensif
Efficacité variable
Spécificité variable
Nécessite une transfection
Knock-down (pas knock-out)
Nécessite une transfection
Antisens (ssDNA): un autre mécanisme
pour le blocage de l’expression des
gènes
Hybridation AS+ARN
puis degradation:
3 modes d’intervention des
antisens dans la cellule:
• dégradation par la RNaseH
• arrêt de transcription
• régulation de la maturation des ARN
(de: http://www.isispharm.com + Scherer et Nature 2003 21, p1457)
La RNAissance
• 1998, RNA interférence : inhibition posttranscriptionnelle de l’expression de gènes
après introduction d’ARNdb (nématode) Fire
et al.
• 2001: siRNA dans des cellules de
mammifères Elbashir et al.
• En 2002, Science magazine élit les RNAi
comme la plus grande avancée
technologique de l’année 2003.
• 2004, association de la génomique
fonctionnelle et du RNAi en oncologie
(Oncogene)
L’ARNi: une nouvelle star
biotechnologique
Principe de
l’interférence
ARN:
RISC
(RNA-induiced sillencing complex)
Spécificité
de la
dégradation
Origines de siRNA
• siRNA
(synthèse chimique)
Prêt à agir après
phosphorylation
• RNAi (viral)
• shRNA (small hairpin)
Produit à partir de plasmides
• miRNA (micro : in vivo)
Découpés par
DICER en siRNA
Mode d’action de l’interférence
Design de siRNA
Critères d’efficacité: >90% de réduction du niveau de la protéine.
[siRNA] de 1 à 20 nM
Éviter les régions 3’ et 5’ non codantes du gène.
Choix d’une séquence siRNA
• Copier une séquence de 21 nt ayant les
bons critères
• S’assurer que cette séquence est
spécifique du gène à cibler (BLAST)
• Commander la séquence et son contrôle
sous forme:
- ARN synthétique
- ADN
NB:Il faut choisir au moins 3 siRNA pour
cibler un gène.
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Méthodes de production des siRNA.
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Méthodes
Avantages
Inconvénients
------------------------------------------------------------------------Synthèse
Chimique
DNA (vecteur ou casette)
Vecteur viral
Rapide
Chimique: grande purité
moins cher
RNAi stable possible
RNAi stable
Utilisable pour des cellules
résistantes aux transfections
par dsRNA/plasmides
RNAi Transitoire
Nécessite une transfection
Chimique: cher
Très laborieux
Nécessite une transfection
Très laborieux
Potentiellement dangereux
Comment introduire le siRNA
dans une cellule de mammifère?
• Par transfection de l’ARN ou de l’ADN (différents
agents lipophiles)
• Par électroporation
• Par infection virale (adenoV*; retroV; lentiV)
Comment introduire le siRNA
dans un animal?
• Par électroporation
• par injection intra péritonéale
• Par injection intraveineuse (apolipoprotéine B)
shRNA transgénique
• génération of knockdown pour des lignées ES
• ‘Transgenic RNA interference in ES cell-derived
embryos recapitulates a genetic null phenotype’
(May 2003, 21, 5 pp 559 - 561), Nature: Kunath et al.
• Exemple: production stable de shRNA du gène p120Ras GTPase-activating protein (RasGAP)
• Il est possible de concentrer sur un seul allèle: grand
intérêt en génétique (dirigé contre une mutation
dominante, exemple le gène Tau dans les troubles
neurologiques)
Comment quantifier l’effet RNAi?
• Au niveau de l’ARNm
– Par Northern blot
– Par RT-PCR
Au niveau de la protéine
–
–
–
–
Par Western Blot
Par immunofluorescence
Par cytométrie en flux
Par des tests phénotypiques ou fonctionnels
Applications
• Génétique inverse (découvrir la fonction
inconnue d’un gène connu).
• Combinaison de l’interférence ARN et
de la génomique (découvrir des gènes
inconnus à partir d’un phénotype connu).
Inhibition par RNAi de l’infection
par HIV-1 de
lymphocytes T
humains
Approche combinatoire
Applications
• Génétique inverse (découvrir la fonction
inconnue d’un gène connu).
• Combinaison de l’interférence ARN et
de la génomique (découvrir des gènes
inconnus à partir d’un phénotype connu).
Banques de siRNA.
Préparation d’une banque de
siRNA
Le premier criblage RNAi
• Stanford's Pat Brown looking at RNAi in
genomewide expression profiling PNAS's
May 27 (2003) p1073.
Depuis,quelques publications…
La difficulté de créer de bonnes banques de siRNA, puis d’avoir un phénotype
facile à mesurer sur des cellules cultivées et tranfectées au format de
criblage à haut débit, explique la faible abondance de publications dans le
domaine.
Perspectives de thérapie
anticancéreuse par ARN
interférence
• Ciblage de molécules impliquées en
carcinogenèse
* voies d’oncogenèse (PTK, APC, PI3K
HIF-1…)
* Régulateurs du cycle cellulaire (RB,
P53, cyclines…)
* Apoptose (BCL2…)
* sénescence (télomérase)
* Stabilité et dégradation des protéines
(cathépsine L)
Perspectives de thérapie
anticancéreuse par ARN
interférence
• Ciblage de gènes impliqués dans les
interactions hôte-tumeur
• Gènes importants pour l’angiogenèse (VEGF,
angiogènine…
• Gènes importants pour la dégradation de la
matrice extracellulaire (u-PA
• Gènes importants pour l’invasion et les
métastases
• Gènes de l’adhésion cellulaire
Perspectives de thérapie
anticancéreuse par ARN
interférence
• Ciblage de gènes important pour la
résistance tumorale à la chimio et/ou
radiothérapie
• Gènes MDR
• Molécules liées aux mécanismes de réparation de
l’ADN ERCC1…
Biblio
• RNA interference collection Nature
reviews Mai 2005
www.nature.com/reviews/focus/rnai
• Prospects of RNA interference therapy for
cancer gene therapy 2006 0 1-13
www.nature.com/gt