Transcript 2-3

Chapitre 2
ème
3
partie
Génétique et
biotechnologie
1. Mécanisme de réplication.
1.1. Principe.
1.2. Mise en évidence.
1.3. Les étapes de la synthèse.
1.4. Mitose et réplication.
2. Les mutations.
2.1. Rappel : la traduction.
2.2. Type de mutations.
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.2. Thérapie génique.
3.3. OGM.
4. Génétique des populations.
4.1. Principe.
4.2. Filiation.
PLAN
1. Mécanisme de réplication.
1.1. Principe.
Réplication semi-conservative: copie par hybridation
de chaque brin d’ADN.
L’enzyme responsable de ce type de réaction est une
DNApolymérase DNA dépendante.
PLAN 3
5’
3‘
5’
3’
T
A
G
G
A
C
T
A
A
C
T
T
A
T
C
C
T
G
A
T
T
G
A
A
T
A
G
G
A
C
T
A
A
C
T
T
A
T
C
C
T
G
A
T
T
G
A
A
3’
5’
3’
5’
1. Mécanisme de réplication.
1.2. Mise en évidence.
Expérience de Meselson
On cultive des bactéries sur un milieu
contenant du 15N
Les bactéries synthétisent du 15N-ADN
Le 15N-ADN est plus lourd
que le 14N-ADN « naturel »
14N-ADN
14N15N-ADN
On transfert les bactéries sur un milieu
contenant du 14N
Les nouvelles bactéries
Synthétisent du 14N-ADN
On mesure la densité de l’ADN
toutes les 20 mn.
PLAN 4
15N-ADN
1. Mécanisme de réplication.
1.2. Mise en évidence.
Expérience de Meselson
A t= 0, l’ADN est du 15N
A t = 20 mn l’ADN est un hybride 15N
(matrice) et 14N (néoformé).
A t = 40 mn on obtient un mélange
(néoformé) et d’hybride.
14N
Les molécules d’ADN sont formées par un
brin parental (matrice) et un brin néoformé.
PLAN 5
14N-ADN
14N15N-ADN
15N-ADN
1. Mécanisme de réplication.
1.3. Les étapes de la synthèse.
La double hélice est déroulée par des hélicases.
Les brins se séparent et sont stabilisés par les
protéines fixatrices d’ADN monocaténaire.
Une amorce en ARN (fragment d’Okazaki) est
synthétisée par l’ADN primase
L’ADN polymérase synthétise le brin dans le sens
5’ --> 3’ à partir de l’amorce.
- Synthèse en continue pour le brin 5’ --> 3’
- Synthèse discontinue pour le brin 3’ --> 5’
Au cours de l’élongation, la polymérase
remplace le fragment d’Okazaki qui la
précède.
Les fragments sont liés par une ligase.
PLAN 6
1. Mécanisme de réplication.
1.4. Mitose et réplication.
La réplication est la première étape de la
division cellulaire.
Elle se déroule à la fin de l’interphase, avant la condensation
de la chromatine en chromosome.
On peut distinguer 4 phases du cycle par rapport à la réplication.
Masse arbitraire
en ADN
G2
2
S
M
Condensation de
la chromatine
G1
G1
1
anaphase
Interphase
mitose
Interphase
0
PLAN 7
3
6
9
t (en h)
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
matrice
TA .TAC. AAA.CCT
AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG
Brin complémentaire
AT .ATG.TTT .GGA.CGG.GAG.TAA.AC
.AGA.CGG.GAG.TAA.AC
ARNm
AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC
AU.AUG.UUU.GGA.CGG.GAG.UAA.AC
Séquence protéique
Changement de base
PLAN 8
Met - Phe - Arg
Gly - Trp - Glu - stop
Changement d’un acide aminé
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
matrice
TA .TAC. AAA.TCC
AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG
Brin complémentaire
AT .ATG.TTT .AGG.CGG.GAG.TAA.AC
.AGA.CGG.GAG.TAA.AC
ARNm
AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC
AU.AUG.UUU.AGG.CGG.GAG.UAA.AC
Séquence protéique
Changement de base
Met - Phe - Arg - Trp - Glu - stop
Changement d’un acide aminé
Pas de changement
PLAN 9
Mutation
silencieuse
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
matrice
TA .TAC. AAA.ACT
AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG
Brin complémentaire
AT .ATG.TTT .TGA.CGG.GAG.TAA.AC
.AGA.CGG.GAG.TAA.AC
ARNm
AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC
AU.AUG.UUU.UGA.CGG.GAG.UAA.AC
Séquence protéique
Changement de base
Met - Phe - stop
Changement d’un acide aminé
Pas de changement
Protéine tronquée
PLAN 10
Mutation
silencieuse
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* Nature de la maladie
Un cas pathologique: la drépanocytose.
La drépanocytose résulte d'une anomalie de la forme des
globules rouges qui lui vaut le nom d'anémie falciforme.
Les globules rouges malades se déforment
sous faible pression d'oxygène. Ils sont
anormalement fragiles et subissent une
destruction rapide. Il en résulte une anémie
sévère et des complications vasculaires variées
qui conduisent à une mort précoce.
L’origine de la maladie provient de la synthèse
d’une hémoglobine anormale.
PLAN 11
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* L’hémoglobine.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
L’électrophorèse de l’hémoglobine permet de mettre en évidence
la présence d’une hémoglobine anormale, HbS.
PLAN 12
Hémoglobine témoin
HbA
Malade 1
HbS
homozygote
Malade 2
HbA + HbS
hétérozygote
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* L’hémoglobine.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
On soumet l’hémoglobine à une hydrolyse partielle puis
à une électrophorèse suivie d’une chromatographie
(technique à 2 dimensions).
On constate la présence d’un peptide différent
dans la cas de HbS, à la suite d’une hydrolyse
partielle.
La différence de séquence doit être très limitée.
PLAN 13
Le séquençage de la protéine permet de mettre
en évidence la modification d’un acide aminé.
Le Glu présent en 6ème position sur la chaîne b
est remplacé par une Val.
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* L’origine génétique.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
sain
malade
Le gène responsable de la maladie est récessif.
1
2
Les parents sont tous les deux porteurs sains.
Hétérozygotes.
La fille malade est
homozygotes.
PLAN 14
3
4
5
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* L’origine génétique.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
sain
On soumet les fragments d’ADN portant les
gènes de l’hémoglobine à l’action d’enzymes de
restrictions.
Une enzyme de restriction est une protéine qui
peut couper un fragment d'ADN au niveau
d'une séquence de nucléotides caractéristique
appelée site de restriction. Chaque enzyme de
restriction reconnaît ainsi un site spécifique.
Si deux brin d’ADN présentent la même
séquence, ils sont coupés au même endroit. A
contrario, s’ils donnent les même types de
fragments nucléotidiques, on en déduit qu’ils
possèdent la même séquence.
PLAN 15
malade
1
3
2
4
5
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* L’origine génétique.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
sain
Les fragments d’ADN obtenus sont séparés par
électrophorèse.
malade
1
1
2
3
4
2
5
Les porteurs sains (1, 2 et 5) possèdent les deux
types d’allèles.
Le malade (3) possède uniquement l’allèle qui
donne un fragment de 1,35 kb
3
4
5
On observe deux types de fragments:
- 1 fragment de 1,35 kb
- 2 fragments de 1,15 et 0,2 kb
PLAN 16
2. Les mutations.
2.1. Mutations ponctuelles.
* La mutation.
Un cas pathologique: la drépanocytose.
On procède au séquençage du gène codant pour
l’hémoglobine.
Séquence normale
CAT GTG GAG TGA
GTA CAC CTC ACT
GUA CAC CUC ACU
Val His Leu Thr
GGT
CCA
CCA
Pro
CAC C - GTG G - GUG G - Val
-
ADN matrice
ADN complémentaire
ARNm
Protéine
Séquence anormale
CAT GTG GAG TGA
GTA CAC CTC ACT
GUA CAC CUC ACU
Val His Leu Thr
GGT
CCA
CCA
Pro
CTC C - GAG G - GAG G - Glu
-
ADN matrice
ADN complémentaire
ARNm
Protéine
PLAN 17
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
matrice
TA .TAC. AAA.
AAA.TCT
CTG.CCC.TCA.TTT.G
.GCC. CTC.ATT.TG
Brin complémentaire
AT .ATG.TTT ..AGA.CGG.GAG.TAA.AC
GAC.GGG.AGT.AAA.C
ARNm
AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC
AU.AUG.UUU.
GAC.GGG.AGU.AAA.C
Séquence protéique
Délétion: élimination d’un
ou plusieurs nucléotides.
PLAN 18
Met - Phe - Asp
Arg - Trp
Gly - Ser
Glu –- Lys
stop- …
Changement de la
séquence de la protéine
Décalage du cadre de
lecture.
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
matrice
TA .TAC. AAA.
AAA.TCT .GCC.
GCC.CTC.ATT.TG
CTC.ATT.TG
Brin complémentaire
AT .ATG.TTT ..AGA.CGG.GAG.TAA.AC
CGG.GAG.TAA.AC
ARNm
AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC
AU.AUG.UUU.
CGG.GAG.UAA.AC
Séquence protéique
Délétion: élimination d’un
ou plusieurs nucléotides.
Cas d’une délétion de trois
nucléotides.
Met - Phe - Arg -- Trp
Trp -- Glu
Glu -- stop
stop
Changement de la
séquence de la protéine
Décalage du cadre de
lecture.
Perte d’un acide aminé
PLAN 19
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
* Nature de la maladie.
Un cas pathologique: la mucovicidose.
La mucoviscidose (pour « maladie des mucus visqueux » en
français) est une maladie génétique, affectant les épithéliums
glandulaires de nombreux organes.
Elle est liée à des mutations du gène CFTR sur le chromosome 7,
entraînant une altération de la protéine CFTR (sigle pour cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator). Cette protéine est
un canal ionique perméable au chlore, au thiocyanate7 dont la
fonction est de réguler le transport du chlore à travers
les membranes cellulaires. Son dysfonctionnement provoque une
augmentation de la viscosité du mucus et son accumulation dans
les voies respiratoires et digestives.
La maladie touche de nombreux organes mais les atteintes respiratoires sont
prédominantes et représentent l'essentiel de la morbidité. D'évolution chronique et
progressive, la maladie s'exprime souvent tôt dès la petite enfance.
PLAN 20
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
* Aspect génétique.
Un cas pathologique: la mucovicidose.
La majorité des mutations du gène CFTR situé sur le
chromosome 7 sont des mutations ponctuelles. Les plus
fréquentes sont:
- des mutations faux-sens (42 %)
- des micro-insertions et des micro-délétions (24 %)
- des mutations non-sens (16 %)
- des mutations d'épissage (16 %)
- des délétions d'un acide aminé (2 %).
- On rapporte également quelques grandes délétions.
PLAN 21
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
* Aspect génétique.
Un cas pathologique: la mucovicidose.
Les mutations du gène CFTR sont regroupées en 6 classes en fonction des conséquences
fonctionnelles qu'elles occasionnent. Certaines mutations entraînent des anomalies
quantitatives ou qualitatives sur la protéine CFTR:
Classe 1 : mutations altérant la production de la protéine CFTR.
Classe 2 : mutations perturbant le processus de maturation cellulaire de la
protéine CFTR.
Classe 3 : mutations perturbant la régulation du canal chlorure.
Classe 4 : mutations altérant la conduction du canal chlorure.
Classe 5 : mutations altérant la stabilité de l'ARNm CFTR.
Classe 6 : mutations altérant la stabilité de la protéine mature.
PLAN 22
2. Les mutations.
2.2. Modification de séquence.
* Aspect génétique.
Un cas pathologique: la mucovicidose.
La mutation la plus fréquente est la mutation « Delta F508 » (ΔF508) qui consiste en une
délétion de trois nucléotides au niveau du dixième exon du gène, aboutissant à
l'élimination d'un acide aminé, la phénylalanine, en position 508.
Séquence normale
-T
-
TGT GGT TTC TAC TAT AAA AGA AA-
ADN non
transcrit
Cys
Protéine
Gly
Phe
Tyr
Tyr
Lys
Arg
-
Séquence anormale
-T
PLAN 24
-
TGT GGT
TAC TAT AAA AGA AA-
Cys
Tyr
Gly
Tyr
Lys
Arg
-
ADN non
transcrit
Protéine
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.1.1. Technique.
Empreinte génétique: analyse des séquences
d’ADN spécifiques d’un individu.
Cette étude consiste à établir la séquence ADN
de certaines portions judicieusement choisies,
du génome.
Prélèvement d’un échantillon.
Purification de l’ADN
Amplification (PCR)
Séquençage
PLAN 24
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.1.1. Séquence répétitives.
Il existe sur l'ADN des portions qui ne codent
pour aucune protéine. Certaines d'entre elles,
présentent des répétitions. Elles sont appelées
les microsatellites et minisatellites. Ces
séquences sont très variables selon les
individus.
Microsatellite
(STR, pour Short Tandem Repeats)
CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG
Minisatellite
(VNTR, pour « Variable Number Tandem
Repeats »)
Répétitions de séquences de 10 à 100 nucléotides
PLAN 25
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.1.2. ADN mitochondrial.
Cet ADN est moins variable que l’ADN chromosomique. Cette étude ne peut pas
déterminer si un échantillon provient d'une unique personne. On pourra toujours
proposer une probabilité que l'échantillon provienne d'un individu précis, mais
cela ne constitue pas une preuve certaine. En revanche, si on obtient 2 ADNmt
différents on peut être sûr qu'il ne s'agit pas de la même personne.
Les médecins légistes étudient les sites HV1 et HV2 de l'ADNmt. Ce sont des
séquences hypervariables (HV) dont les différentes versions sont nombreuses et avec
des fréquences relativement faibles (quelques % de la population générale).
Avantage de cette méthode.
Pour des échantillons fortement dégradés ou sur un cheveu sans bulbe, il est parfois impossible
d'obtenir un profil complet de tous les microsatellites. Dans ce cas, on peut utiliser l'ADN
mitochondrial car il y en a de nombreuses copies dans une cellule, tandis qu'il y a rarement plus
de 1 ou 2 copies de l'ADN nucléaire.
PLAN 26
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.1.3. Chromosome Y.
Il existe sur le Chromosome Y des régions hypervariables, nommées
STRY.
Inconvénient:
Le chromosome Y n'est présent que chez les individus de sexe
masculin. Il ne pourra être effectué sur une femme.
Avantage:
Le chromosome Y est transmis par le père, et l’analyse de ce
chromosome permet de faire les tests de paternité, lorsque le père n'est
plus vivant.
PLAN 27
3. ADN: outil biotechnologique.
3.1. Empreinte génétique.
3.1.4. Analyse ADN et justice.
Il existe un certain nombre de limitation
dans l’utilisation d’une analyse ADN dans
une enquête.
Erreur pendant l’analyse.
Mauvaise interprétation des résultats.
Contamination de l’échantillon.
Etendue de la base de données.
La présence de l’ADN d’un suspect sur une scène de crime ne signifie
pas automatiquement la participation au crime.
Dépôt de faux échantillons d’ADN par le criminel
PLAN 28
3. ADN: outil biotechnologique.
3.2. Thérapie génique.
3.2.1. Principe.
La thérapie génique utilise des acides nucléiques (ADN ou ARN) pour soigner ou
prévenir des maladies. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en
délivrant aux cellules :
un gène fonctionnel qui remplace le gène défectueux à l’origine de
la maladie (transgène).
un gène à action thérapeutique
de l’ARN capable de réguler ou bloquer partiellement l’expression
d’un gène altéré.
Ces acides nucléiques sont le plus souvent transportés dans les cellules du patient
grâce à un vecteur viral, mais ils peuvent également être injectés directement
dans les cellules, sous forme d’ADN nu.
PLAN 29
3. ADN: outil biotechnologique. Les protocoles de thérapie génique varient en fonction des
indications et des objectifs thérapeutiques à atteindre.
3.2. Thérapie génique.
Cependant, ils consistent toujours à modifier génétiquement
3.2.2. Méthode.
« Modification in vivo »
les cellules du patients, ex vivo ou in vivo, de façon pérenne
ou transitoire.
Cas du traitement de carcinomes de la tête et du cou.
On prépare le transgène. Il s’agit d’un gène suppresseur de tumeur (p53).
Il est intégré dans un vecteur, un adénovirus, virus capable d’infecter les cellules
humaines.
Plus de 10 000 patients ont été traités par ce médicament à ce jour, sans effet
indésirable notable.
PLAN 30
3. ADN: outil biotechnologique.
3.2. Thérapie génique.
3.2.2. Méthode.
« Modification ex vivo »
Les protocoles de thérapie génique varient en fonction des
indications et des objectifs thérapeutiques à atteindre.
Cependant, ils consistent toujours à modifier génétiquement
les cellules du patients, ex vivo ou in vivo, de façon pérenne
ou transitoire.
Cas d’une maladie monogénique qui affecte les cellules sanguines.
Des cellules souches hématopoïétiques (cellules à l’origine de l’ensemble des cellules
sanguines) sont prélevées chez le patient lors d’une procédure qui s’apparente à une
simple prise de sang.
Ces cellules sont ensuite modifiées ex vivo : un vecteur est utilisé pour leur délivrer un
transgène thérapeutique
Elles sont placées en culture pendant quelques jours
Lorsque les cellules ainsi traitées commencent à exprimer le gène thérapeutique, elles
sont finalement réinjectées au patient par perfusion veineuse.
PLAN 31
Les cellules modifiées vont alors proliférer dans l’organisme du patient et, à priori,
contribuer à le soigner
3. ADN: outil biotechnologique.
3.2. Thérapie génique.
3.2.2. Méthode.
Récapitulatif
PLAN 32
3. ADN: outil biotechnologique.
3.3. OGM.
3.3.1. Principe.
Un « organisme génétiquement modifié » est un
organisme vivant (micro-organisme, végétal ou
animal) dont le génome a été modifié
artificiellement.
Nombreuses méthodes
La sélection.
Choix des reproducteurs
L’hybridation.
Croisement entre
sous-espèces
Transgénie
Implantation
de nouveaux gènes
PLAN 33
3. ADN: outil biotechnologique.
3.3. OGM.
3.3.2. Intérêt.
La manipulation génétique a pour but d’introduire
de nouvelles caractéristiques
Chez les cellules ou organismes modifiées.
Résistance aux insectes
Agronomie
Résistance aux herbicides
Permet de revendre tous les ans les
graines aux producteurs.
Gène de stérilité
Production d’insuline
Médecine
Production
(hémophilie
facteur
VIII
Ces protéines sont produites par des
bactéries, des levures ou des cellules
de mammifère en culture.
Hormone de croissance
PLAN 34
Industrie
Modification des marqueurs
du soi pour une xénogreffe.
Production de bioéthanol
Stade de recherche
Carburant synthétisé par des algues
3. ADN: outil biotechnologique.
3.3. OGM.
3.3.2. Polèmique.
Risques directs
biodiversité
Apparition d’un facteur toxique ou cancérigène.
Uniformisation des culture sous l’influence de
l’industrie agro-alimentaire.
Moins d’adaptabilité des cultures aux changements
climatiques et à l’apparition de maladie.
Utilisation massive des herbicides
l’introduction de gènes de résistance.
Contamination
depuis
On ne peut pas empêcher la dissémination des
graines ou du pollen.
Disparition à moyen terme des souches sauvages ?
PLAN 35
4. Génétique des populations.
La génétique des populations est l’étude de la
4.1. Principe.
distribution et de l'évolution au cours du temps des
fréquences alléliques et génotypiques dans les
populations.
On étudie la fréquence de certains allèles dans différentes populations. Une différence notable
indique que ces population possèdent des origines différentes.
Il existe plusieurs types d’étude selon la nature des allèles étudiés.
Autosome
Comparaison classique sans spécificité autre que
l’allèle étudié.
Chromosome Y
Lignée patriarcale (transmis de père en fils)
Chromosome
mitochondrial
Lignée matriarcale (transmis de mère en fille)
PLAN 36
4. Génétique des populations.
4.1. Principe.
PLAN 37
Répartition des allèles des groupes sanguins.
4. Génétique des populations.
4.2. Filiation.
Les gènes subissent des mutations à intervalle
régulier. Un certain nombre de ces mutations
sont conservées par une espèce donnée.
Si deux espèces se séparent sur l’arbre phylogénétique, elles
auront tendance à subir des mutations différentes.
Plus les différences sont nombreuses, plus le temps écoulé
depuis la séparation est grand.
Il est actuellement impossible d’étudier la
totalité du génome. Il convient donc de choisir
les génes les plus adaptés à l’étude. Il s’agit des
marqueurs.
PLAN 38