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Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo: Aplicações Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Identificação Celular por Dispersão FS e SS Monócitos Granulócitos Linfócitos Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Imunofenotipagem Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia IOTest 3 Combinations List 24 Relevant Tubes 2 Controls One tube is for intra-cellular testing Kappa & Lambda polyclonals from Dako FITC- and PE-conjugations performed at IOT Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia IOTest 3 Combinations List + Target Diseases PN FITC PE ECD TARGET DISEASE IM3464 cMPO cCD79a cCD3 ACUTE CLASSIFICATION IM3465 Kappa Lambda CD19 B-CLL, IM3466 CD5 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES IM3467 CD20 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES IM3468 FMC7 CD23 CD19 B-CLL, MANTLE CELL IM3469 CD5 CD23 CD19 T vs. B CLL, Mantle Cell IM3470 CD25 CD11c CD19 HCL IM3471 CD103 CD11c CD19 HCL IM3472 CD19 CD10 CD45 B-ALL IM3473 CD38 CD56 CD45 MM, Plasma Cells IM3474 CD14 CD16 CD45 MYELOID CLASSIFICATION INCLUDING IMMATURE GRANULOCYTES (CD16dim) IM3475 CD71 CD33 CD45 MYELOID, ERYTHROID, DIFF IM3476 CD34 CD33 CD45 AML IM3477 CD34 CD117 CD45 IMMATURE MYELOID IM3478 HLA-DR CD34 CD45 AML vs ALL IM3479 HLA-DR CD13 CD45 AML Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia IOTest 3 Combinations List + Target Diseases PN FITC PE ECD TARGET DISEASE IM3480 CD15 CD33 CD45 AML, APL, CML IM3481 CD14 CD13 CD45 AMML IM3482 CD41 Glyco A CD45 ACUTE MEGALO, DIFF, M7, MYELODISPLASIA IM3483 HLA-DR CD7 CD45 T-ALL IM3484 CD5 CD7 CD3 T-CLL IM3485 CD8 CD4 CD3 T-CLL IM3486 CD25 CD4 CD3 HTLV, SEZARY SYNDROME IM3487 CD16 CD56 CD3 LGLL IM3488 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. IM3489 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. CD45 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Quantificação antigénica Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Quantificação de antigénios em Citometria de Fluxo Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia BioCytex MARQUIS TECHNIQUE Beads contain calibrated amounts of antimouse IgG molecules. Size mimics size of target molecule/receptor. Amount of molecules on beads reflects expression level of target molecule/receptor. Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure Calibration Beads Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure Negative Control Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure CD38 Positive Sample Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Data Analysis Procedure 1 0 0 .0 0 0 M A b m o le c u le s 29,777 1 0 .0 0 0 1 .0 0 0 610 100 0 ,1 1 ,0 1.8 1 0 ,0 1 080.0 0 ,0 1 0 0 0 ,0 M FI Fig. 7 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Pesquisa de populações raras Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia 600 400 200 Stimulation 0 RATIO [short/long] 800 1000 Estudos Cinéticos 0 36 72 108 Time (Seconds) 144 180 Calcium Flux - Indo-1 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Análise de Ciclo Celular G0 /G1 M G2 G0 G1 S C o u n t G2 /M S 0 200 400 2N 600 4N 800 1000 DNA content Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Apoptose Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Separação Celular Sensor Fs 488 nm laser Formação de gotículas Tempo Detectores de Fluorescências - + Placas Carregadas Coincidência - Pureza e Eficiência Prof. Doutor José Cabeda Tubos para Recolha do Produto Separado Técnicas de Imunologia QC Workflow Basic Elements of Daily QC Fix Problem Call Service Alignment Check Fluorescent Standard Troubleshoot Maintenance Color Compensation FAIL Process/ Method Control PASS Prof. Doutor José Cabeda Patient Analysis Run Patient Obtain Results Generate Report Test Reimbursement Técnicas de Imunologia AUTOMATIZAÇÃO Q-Prep™ TQ-Prep™ Prof. Doutor José Cabeda PrepPlus Técnicas de Imunologia TQ-Prep / ImmunoPrep Reagent TQ-PREP Sistema automático de lisis de eritrocitos No requiere lavado Preserva la morfología Utiliza carruseles compatibles con XL-MCL, FC500, PrepPlus y CellPrep Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PrepPlus – TQ-Prep Sistema automático de carga de muestra y reactivos para citometría de flujo Utiliza tubos primarios de cualquier marca Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación para homogeneizar la muestra Controlado por el TQPrep Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia PrepPlus – TQ-Prep Posibilidad de carga desde tubo abierto 3 soportes diferentes para reactivos Puede cargar anticuepos monoclonales, FlowCount y reactivos de control de calidad Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CellPrep Sistema de lavado celular por fibra hueca Sustituye a la centrifugación Mantiene la viabilidad celular Mantiene la morfología y preserva células lábiles No activa ni destruye plaquetas Utiliza sangre entera, sangre lisada y cualquier suspensión celular Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia CellPrep Fibras huecas con poros de 0.65 µm, que permiten la salida de moléculas y líquido de la suspensión original Permite la concentración final de la muestra Diferentes programas pregrabados, así como posibilidad de crear programas propios Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Imagem: Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia Patológica Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Tipos de amostras possiveis de analisar por Citometria de Imagem: Tecido sólido Tecido líquido Amostra Tecido “criopreservado ” Sem preservação Tecido a “fresco” Etanol Com preservação Tecido fixado Paraformaldeido Tecido a “fresco” congelado Formaldeido Glutaraldeido e incluído em parafina Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Parâmetros possíveis de analisar por Citometria de Imagem: • • • • • • • • Total de partículas Forma Tamanho Área Diâmetro Perímetro “Perfeição” Irregularidade Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Requisitos Básicos num Citómetro de Imagem: Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Captação dos Parâmetros de Análise: Branco 80 100 DOI 100 DOI Preto DOI Núcleo Marcado 80 100 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 Tamanho Tamanho Prof. Doutor José Cabeda Tamanho Técnicas de Imunologia Citometria de Imagem: Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Protocolo para Citometria de Imagem: Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, processado e incluído em parafina. Corte a 8m, extensão em lâminas de gelatina Desparafinar Pós fixar com fixador de Bohm Hidratar Efectuar uma Hidrólise Ácida Marcar as células com reagente de Shiff Lavar com SO2 Desidratar Montar Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de Imagem Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia MetaCyte - concept • microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps • objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia MetaCyte - concept • on screen review of analyzed cells • false positives can be rejected • cells suitable for analysis are preselected with a mouse click • preselected objects can be automatically relocated at 100x to capture high resolution images for Prof. Doutor José Cabeda analysis Técnicas de Imunologia MetaCyte - concept • histogram or scatter plot display of measured features • gating for selection of subpopulations • relocation of cells detected in a previous scan after re-staining 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia MetaCyte - concept CCD Camera MetaCyte Motorized stage (x,y) PC Win 9x/NT image analysis microscope control Motorized microscope (z) Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia