Transcript 纸层析法观察转氨基作用

生物化学实验 CQMU
纸层析法观察转氨基作用
P、63
生物化学与分子生物学实验室
2008.09
实验目的
学习氨基酸纸层析的基本原理
掌握氨基酸纸层析的操作技术
实验原理
 层析技术
层析法又称色谱法，是一种根据
物质的物理或化学性质不同（如
吸附力、溶解度等）而建立的物
质分离、分析方法，是近代生化
最常用技术之一。
基本原理：在层析系统（固定相＋流动相）中，
由于混合物各组份理化性质不同，与两相的相互
作用（吸附、溶解等）能力不同，随着流动相不
断向前移动，不同组分最终得以分开。
纸层析
属于分配层析，利用混合物在二种或二种以上
的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分
离的方法。
以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸纤维上形
成固定相，有机溶剂如酚等为流动相。
把预分离物质加在纸的一端，使流动溶剂经此
向另一端移动，随着流动相的移动，待分离物
质进行连续、动态的不断分配。在固定相分配
趋势大的组份，随流动相移动的速度慢；反之，
在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，
最终不同的组份彼此分离。
 ALT催化的转氨基反应
纸层析观察转氨基作用的技术基础：
丙氨酸和谷氨酸可以通过纸层析得以分离
实验步骤
 肝匀浆制备：
 转氨基反应：取试管二支，分别标明测定管与
对照管，各加入肝匀浆10滴，测定管加入37℃
水浴保温10分钟，对照管放入沸水浴中煮10分
钟，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1
mol/L 丙氨酸10滴，0.1 mol/L α-酮戊二酸10滴，
pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液1.5 ml，摇匀，放
进37℃水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测
定管放入沸水浴中煮沸10分钟以终止反应，取
出冷却后，过滤。取滤液备用。
层析：准备滤纸→点样→层析→终止。
1. 测定管上清液
2. 0.1 mol/L丙氨酸
3. 对照管上清液
4. 0.1 mol/L谷氨酸
 显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用
喷雾器喷上0.5 %茚三酮之丙酮溶液，使
滤纸全部湿润再用吹风机或60℃烘箱干燥
之，此时可见紫色斑出现。
 分析：比较色斑的位置及色泽深浅，计
算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。
注意事项
 层析液中含有腐蚀性酚，取用时注
意安全，防止溅到皮肤及眼睛；
 操作中接触滤纸前要洗手擦净，并
尽量避免手与滤纸中间部位接触；
 点样点不宜过大，直径小于0.5 cm。
开始实验！