Transcript Előadás10

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
Elválasztástechnika
kv1n1lv1
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Tételek
1. A kromatogram és kromatográfiás csúcs főbb jellemzői, tányérelmélet
2. A gázkromatográfiás rendszer felépítése, a gázkromatográfia állófázisai
3. Mintabevitel a gázkromatográfiában
4. A gázkromatográfia mozgófázisai, sebességi elmélet
5. Gázkromatográfiás detektorok (kivéve MS)
6. Tömegspektrometriás detektálás a gázkromatográfiában
7. Minta-előkészítés
8. Elektromigrációs módszerek
9. A HPLC-s rendszer felépítése, az egyes elemek szerepe és működése
10.A folyadékkromatográfiás állófázisok fajtái, jellemzése
11.A folyadékkromatográfiás mozgó fázisok és a gradiens elúció
12.Normál fázisú folyadékkromatográfia
13.Fordított fázisú folyadékkromatográfia
14.MIP, affinitáskromatográfia és gélkromatográfia, HIC, HILIC
15.Ionos összetevők elválasztására alkalmas folyadékkromatográfiás módszerek
16.Folyadékkromatográfiás detektorok (kivéve MS)
17.Tömegspektrometriás detektálás a folyadékkromatográfiában
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Izokratikus ill. gradiens elúció
mAU
IZOKRATIKUS
tR (min)
GRADIENS
mAU
tR (min)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gradiens elúció
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Pump summary
The pump is the most critical piece of equipment for a successfully
operating HPLC.
Performance Parameters for HPLC pumps:
 Flow Precision
 Flow Range
 Delay Volume
 Pressure Pulse
 Composition Precision
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
MIP-Molecularly Imprinted Polimer
Célvegyület
Elrendeződés
Célvegyület
Polimerizáció (UV vagy T)
Monomerek
Extrakció
Célvegyület
- célvegyület
MIP
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Affinitás kromatográfia
•Állófázis (mátrix)
90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz
származékok vagy egyéb polimer.
távtartó +
ligandum
+
+
+
+
+
+
+
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
Gél szemcse
Pórusok (dp> 100A)
Állófázis
a kolonnában
Nincs kölcsönhatás a minta-
molekula és az állófázis között!!
Eltérő méretű molekulákból álló minta
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Gélkromatográfia
•Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél
nincs visszatartás (holt térfogat);
•Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van
visszatartás;
•Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek
teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);
lgM
Teljes kizárási tartomány
Mérési tartomány
Teljes áteresztési tartomány
Elválasztástechnika
2011
V (ml)
Eke Zsuzsanna
Ismétlés vége
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só)
N+
Elválasztástechnika
-
Mérendő komponens ionos formája
C18 szilárd fázis
Ion-párképző só
[Molekula ION]
N+
2011
[Molekula ION]
-
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só)
O
S
Ionpárképző só
[Molekula ION]+
O
Mérendő komponens ionos formája
C18 szilárd fázis
O
O
S
[Molekula ION]
O
+
O
Esetleg: CF3COO-; BF4-; ClO4-, PF6Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Na+
SO3-Na+
SO3-[ION]+
[ION]+
SO3-Na+
Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)
Módosított állófázis
C18 szilárd fázis
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek:
• Ionpárképző koncentrációja;
• Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.)
• Szerves modifikátor típusa, mennyisége;
• Puffer koncentrációja, pH-ja;
• Idegen só koncentrációja;
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis
hatása
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserés
folyadékkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserés folyadékkromatográfia
Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik;
Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség
egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g);
„Ioncserélő gyanták”
A. Ionkizárásos kromatográfia
B. Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ioncserélő töltetek
KATION CSERÉLŐK
Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO4-)
ANION CSERÉLŐK
Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino,
imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal
AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex
szerkezettel
ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK
DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkizárásos folyadékkromatográfia
Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation
cserélő gyanta;
Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal);
Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás
(cukrok, savak, alkoholok elválasztása)
HOOC-R
HO-R
Cukor
-
-
SO
-OOC-R
3
SO
3
pórus
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves
savak és bázisok meghatározására használjuk
Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő
gyanta;
Eluens: puffer;
Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Hordozó
Üveggyöngy
ioncserélő
Jellemzők
Típus
Filmszerű
Gyors elválasztás, közepes
hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8,
(37-44 mm)
szárazon töltik, könnyen
bevonattal
Szilikagél alapú
beszennyeződik
Mikropórusos (10
Közepes gyorsaság,
nm)
leghatékonyabb,
pH 2-8, pépes töltés
Polisztirol
Elválasztástechnika
Mikropórusos
Lassú, kis hatékonyságú, jó
(10 nm)
kapacitás, pH 0-12, pépes töltés
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Visszatartást befolyásoló tényezők:
Növekvő pH
Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás;
Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan
eluálódnak;
Puffer erősség nő
Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a
retenció;
Nő a hőmérséklet
Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Vezetőképesség mS
Szupresszió előtt
Szupresszió után
Elválasztástechnika
2011
Idő (min)
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!)
cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése)
Cl- meghatározása
Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3):
Gyanta-H+ + Na+ HCO3 --> Gyanta-Na+ + H2CO3
Gyanta-H+ + Na+ Cl--> Gyanta-Na+ + HCl
A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion
vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő
cseréjével jelentősen megnő.
Na+ meghatározása
Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl):
Gyanta-OH- + H+ Cl- --> Gyanta-Cl- + H2O
Gyanta-OH- + Na+ Cl- --> Gyanta-Cl- + Na+ OHA mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl- (76 S*cm2/equiv) ionokat
OH- ionokra (198 S*cm2/equiv).
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
2 - Kloridion / 3. 38
Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop
7 - Szulfation / 8. 12
qc0205
100
6 - Foszfation / 7. 07
20
5 - Nitration / 5. 50
40
4 / 4. 80
60
3 - Nitrition / 3. 92
1 - Fluoridion / 2. 48
µS
80
0
0
5. 00
10. 00
Minutes
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
100056
70. 0
4 - Szulfation / 8. 17
IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop
1 - Fluoridion / 2. 48
µS
40. 0
30. 0
20. 0
10. 0
3 - Nitration / 5. 58
50. 0
2 - Kloridion / 3. 38
60. 0
0
0
5. 00
10. 00
Minutes
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Ionkromatográfia
21
TERMÉSZETES AMINOSAV
IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS
ELVÁLASZTÁSA
Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN
(30X0,46 cm)
3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens
DETEKTÁLÁS:
NINHIDRIN
(post-column)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofób kölcsönhatású
kromatográfia
(Hidrophobic Interaction Chromatography,
HIC)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HIC vs. RPC
Mindkét technikában közös és jellemző:
- Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum.
- A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás.
- A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok
határozzák meg.
- Alkalmasak fehérjék elválasztására.
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HIC vs. RPC
KÜLÖNBSÉGEK:
- A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja.
- A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában
(folded) marad, kisebb a denaturáció esélye.
- A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát
(unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób
jellege határozza meg.
- A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót
szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése
a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el.
Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye.
- A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis
(ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a
domináns tényező
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Hidrofil kölcsönhatású
folyadékkromatográfia
(Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
HILIC
Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában
Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel
(A víz az erős oldószer !!!)
Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható
komponensek elválasztására
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Detektorok
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A detektorok legfőbb jellemzői
Szelektív – univerzális
Dinamikus tartomány
Linearitási tartomány
Érzékenység
Destruktív – nem destruktív
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A folyadékkromatográfiás detektorok
Komponensek tulajdonságát észlelik
UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS)
Fluoreszcenciás detektor (FLD)
Elektrokémiai detektor (ECD)
Radiokémiai detektor (RD)
Tömeg detektorok (MSD)
Előnyök: specifikusság,
érzékenység, szelektivitás
Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax)
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
A folyadékkromatográfiás detektorok
Mozgófázis tulajdonságát észlelik
Törésmutató detektor (RID)
Vezetőképesség detektor (CD)
Fényszórásos detektor (LSD)
Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális
Hátrányok: zaj, érzékenység
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
UV-VIS detektor
Alapelv: Lambert-Beer törvény
I
A   log10    l  c
I0
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
UV-VIS detektor
Chromophore
Structure
max(nm)
Amine
- NH2
195
Ethylene
-C=C-
190
C=O
195
Ester
- COOR
205
Aldehyde
- CHO
210
Carboxyl
- COOH
200-210
Nitro
- NO2
310
Ketone
Phenyl
202, 255
Naphthyl
220, 275
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
UV-VIS detektor – UV spektrum
Abszorbancia
Benzamidofenol
(mAU)
Paracetamol
Kromatográfiás elválasztás;
Minél magas hullámhossz annál
280 nm
szelektívebb
4
3
  max pH függése
2
 oldószerek, adalékok UV elnyelése
1
0
200
250
300
350
Hullámhossz (nm)
Elválasztástechnika
400
2011
Eke Zsuzsanna
UV-VIS detektor – UV Cutoff
Solvent
UV Cutoff (nm)
Acetonitrile
Water
Cyclohexane
190
190
195
Hexane
Methanol
Ethanol
Diethyl Ether
200
210
210
220
absorbance equals 1,
Dichloromethane
220
reference.
Chloroform
Carbon Tet
240
265
Tetrahydrofuran
280 (220)
Toluene
285
Elválasztástechnika
UV cutoff is the
wavelength at which
measured in a
1 cm cell with air as a
2011
Eke Zsuzsanna
VWD – Variable Wavelenght detector
Diffrakciós rács
lencse
tükör
tükör
deutérium lámpa
tükör
Fénynyaláb
A diffrakciós rács monokromatikus
osztó
fényt állít elő
Átfolyó cella
Minta
fotodióda
tükör
A monokromatikus fényt megosztjuk a
referencia és minta fotodióda között
Az intenzitásbeli különbséget a
cellában történő abszorbancia okozza
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector
Vis Lamp
Achromatic Lens
Diode Array
Detector Flow Cell
UV Lamp
Homium Filter
Optical Slit
Elválasztástechnika
2011
Grating
Eke Zsuzsanna
Deutérium lámpa tesztje
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
On-line spektrum
Spectra
Absorbance
Wavelength
Time
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna
Csúcstisztaság
Peak with time marker for spectra selection
Spectral differences at different points of peak elution
Elválasztástechnika
2011
Eke Zsuzsanna