Transcript E. coli
Chapter 13. Production of protein from cloned genes - 1929년 Alexander Fleming Penicillium 항생물질 대량생산 • 생명공학 산업 - Batch culture (일괄처리 배양) - Continuous culture (연속배양) • 박테리아에 의한 동물 단백질 생성 개요 • E.coli에서 유전자 발현을 위한 가장 중요한 세가지 신호 1. Promoter ; - 유전자의 전사가 시작되는 지점을 표시 - 시그마 단위체 ( subunit)에 의해 인식 2. Terminator ; - 전사가 끝나는 유전자상의 끝지점 - Stem loop structure 3. Ribosome binding site ; - ribosome이 mRNA와 결합하는 위치 ; consensus sequences (일치서열) • Typical promoter sequence for E. coli and animal genes - E. coli의 RNA polymerase가 human promoter에 결합되지 않는다. • The production of recombinant protein ; - Expression vectors - 발현벡터 • Promoter - Expression vector에 중요한 구성 요소 . 유전자 발현 조절 . mRNA 합성속도를 조절 • 발현벡터 제작 1. Promoter의 전사능력 - Strong promoter ; 높은 전사량 - Weak promoter • 발현벡터 제작 2. Promoter의 조절방법 - 유도성 유전자 - 억제성 유전자 • lac promoter ; - IPTG에 의해 전사 유도 • trp promoter ; - Tryptophan에 의해 전사억제 - Indoleactic acid에 의해 전사 유도 • tac promoter ; - trp + lac promoter - IPTG에 의해 유도 • PL promoter ; - cI 유전자 (temp.-sensitive) - >30oC , 전사 유도 - < 30oC, 전사 억제 • A typical cassette vector • Gene fusion 1. Ribosome binding site의 2차구조 방지 2. Fusion protein의 안정화 3. 숙주세포에 의한 fusion protein의 분해 방지 4. E.coli signal peptide, 특정위치 5. Affinity chromatography 를 이용, 단백질 회수 및 정제가 쉽다. • Foreign protein recovery - Cyanogen brimide ; methionine - Thrombin ; arginine • General problems with the production of recombinant protein in E. coli 1. 외래유전자의 염기서열로 인한 문제들 - 대장균에서 intron을 자를 수 없다. Ex) cDNA 이용 - 종결신호로 작용하는 유사 염기서열 Ex) oligonucleotide-directed mutagenesis - 유전자의 codon usage Ex) E.coli의 tRNA 변형 2. 숙주로서의 대장균의 한계성 - 대장균이 재조합단백질을 정확하게 processing 하지 않을 수도 있다. Ex) 동물 단백질; glycosylation - 대장균이 재조합단백질을 정확하게 folding 하지 않을 수도 있다. Ex) inclusion body 형성; 불활성화 - 대장균이 재조합단백질을 분해시킬 수도 있다. • Recombinant protein from yeast & filamentous fungi - GAL promoter ; galactose PHO5 promoter ; 인산의 양 CUP1 promoter ; 구리 AOX promoter ; methanol, 알코홀 산화효소 - Glucoamylase promoter ; Starch에 의해 전사 유도 Xylose에 의해 전사 억제 - Cellobiohydrolase promoter; cellulose A typical glycosylation • Protein production in insect cells - Baculoviruses ; 곤충에서는 흔하지만 척추동물은 감염시키지 않는다. Polyhedrin 유전자 ; neclear inclusion body, 전체 세포단백질의 50% • Pharming • -lactoglobulin promoter ; - Mammary tissue activity - 우유로 분비 - 많은 양의 단백질 생산 - 정제하기가 쉽다.