Transcript Fermentatie

TETRA Vergadering Gebruikersgroep IV
Project 80108:
Valorisatie van (ligno-)cellulose reststromen - VaLiCel
KULeuven: fermentatie van hydrolysaat
Materiaal en Methoden
Vlaslemen
voorbehandeld
Voorbehandeling:
Zeven
Wassen met 60%
EtOH en water
materiaal
Saccharificatie:
droog
Organosolv
3 d roeren bij 50°C
3 d schudden 150 rpm 50°C
gehydrolyseerd
HoGent
MCB/KULeuven
materiaal
Inactivatie van enzyme
5 min 70°C
gehydrolyseerd
Materiaal + gist
Fermentatie
nat
Materiaal en Methoden
Fermentatie
- voorgroei gist
- Hydrolysaat
In YPD tot stationaire fase
enzyme inactiveren
- tellen -> concentratie
ethanol en suiker bepalen
- hydrolysaat: 80 mL per fermentatiebuis;
controle: YP 4.2% glucose
- inoculeren met 6.3 x 106 cellen/mL
- fermentatie: 25°C; continu roeren
- volgen a.h.v. gewichtsverlies (dr. CO2 productie)
- op het einde:
- afkoelen; minimum 1 dag 4°C
- “bier”: centrifugatie -> gist in neerslag (verwijderen)
supernatans -> ethanol; suiker (glucose en andere)
“cake”: cellen in suspensie -> viabiliteit
Fermentatie reeks 1
- 3 stammen (S. cerevisiae)
- 3 media
YP - 4.2%glc
(niet aangezuurd)
gecentrifugeerd
hydrolysaat
hydrolysaat
Bevat 4.2% glucose en
0.69% xylose
Fermentatie reeks 1
- 3 stammen (S. cerevisiae)
- 3 media
05022010
Fermentatie reeks 1: resultaten
1. Fermentatiesnelheid
TETRA fermentatie 1
Ethanol red glc
PE2 glc
Xyl glc
Ethanol red hydr. sup.
PE2 hydr. sup.
Xyl hydr. sup.
Ethanol red hydr..
PE2 hydr.
Xyl hydr.
100.20
Relatief gewicht
100.00
99.80
99.60
99.40
99.20
YP glucose
99.00
98.80
0
24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
Gecentrifugeerd
hydrolysaat
264
288
Tijd (u)
312
336
360
384
408
432
456
hydrolysaat
480
504
528
552
Fermentatie reeks 1
2. Ethanol productie: met Anton Paar Beer Alcolyzer Plus
3. Xylose concentratie: HPAEC-PAD, HoGent
4. Viabiliteit: met FACScan
Fermentatie reeks 1: resultaten
stam
Eth.r
PE2
Xyl
duur
fermentatie
(u)
114
114
114
fermentatiemedium
Ypgluc
Ypgluc
Ypgluc
CO2(g)
1.33
1.34
1.32
%EtOH verwacht
(afgeleid van CO2)
2.20
2.22
2.18
%EtOH (v/v)
2.24
2.25
2.25
xylose
over (%)
/
/
/
viabiliteit (%)
91.5
91.6
86.5
Eth.r
PE2
Xyl
235
235
263
sup hydrolysaat
sup hydrolysaat
sup hydrolysaat
2.00
2.04
2.03
3.31
3.37
3.34
3.26
2.89
3.24
0.65
0.68
0.53
91.7
67.6
95.2
Eth.r
PE2
Xyl
405
547
547
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
2.08
2.12
1.98
3.43
3.50
3.26
3.27
3.24
2.97
0.72
0.73
0.64
N.M.
N.M.
N.M.
N.M.:niet mogelijk
Fermentatie reeks 1: resultaten
stam
Eth.r
PE2
Xyl
duur
fermentatie
(u)
114
114
114
fermentatiemedium
Ypgluc
Ypgluc
Ypgluc
Eth.r
PE2
Xyl
235
235
263
Eth.r
PE2
Xyl
405
547
547
CO2(g)
1.33
1.34
1.32
%EtOH verwacht
(afgeleid van CO2)
2.20
2.22
2.18
sup hydrolysaat
sup hydrolysaat
sup hydrolysaat
2.00
2.04
2.03
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
2.08
2.12
1.98
Eth.r
%EtOH (v/v)
2.24
2.25
2.25
xylose
over (%)
/
/
/
viabiliteit (%)
91.5
91.6
86.5
3.31
3.37
3.34
3.26
2.89
3.24
0.65
0.68
0.53
91.7
67.6
95.2
3.43
3.50
3.26
3.27
3.24
2.97
0.72
0.73
0.64
N.M.
N.M.
N.M.
N.M.:niet mogelijk
Xyl
PE2
05022010
Fermentatie reeks 1
Berekening
-Uit 4.22% glucose: 2.72% EtOH maximum
Bekomen:
- waarden voor fermentatie in YP-4.2% glucose: rond 2.2% ethanol
- waarden voor fermentatie in hydrolysaat: rond 3.3% ethanol
Fermentatie reeks 1
- Analyse hydrolysaat (HPLC)
“Dextrose”: 5.1%
“C6 suikers”: 6.2% -> 3.99% ethanol verwacht
“fructose”: 1.1%
Fermentatie reeks 1
Besluiten
- de suikers van het vlaslemen hydrolysaat worden goed gefermenteerd
- de fermentatie verloopt trager dan in YP-glucose
- bij één stam heeft het hydrolysaat een (lichte) daling van de viabiliteit tot
gevolg
- de fermentatie in het volledige hydrolysaat verloopt nog trager dan in het
afgecentrifugeerde, maar de ethanolproductie is vergelijkbaar
- de stam die een cassette bevat om xylose te fermenteren doet het niet beter
dan de andere stammen (maar xylose is heel laag)
Fermentatie reeks 2
- 7 stammen
- media: - YP + 4.2% glucose, aangezuurd tot pH 4.8
- gecentrifugeerd hydrolysaat
Fermentatie reeks 2: resultaten
1. Fermentatiesnelheid
TETRA fermentation 2
99.95
Ethanol red glc
Arab glc
Lalvin VIII6 glc
MUCL 11987glc
46EDVglc
EXF-3424glc
Ethanol red hydr
Arab hydr
Lalvin VIII6 hydr
MUCL 11987 hydr
46EDV hydr
EXF-3424hydr
CAT1 hydr
Eau de Vie hydr
CBS1585 hydr
Relatief gewicht
99.75
99.55
99.35
99.15
98.95
0
24
48
72
96
120
144
168
Tijd (u)
192
216
240
05022010
264
288
312
Fermentatie reeks 2: resultaten
1. Ethanol productie; viabiliteit
stam
Eth.r
Arab
Lalvin
MUCL
46EDV
EXF
Eth.r
Arab
Lalvin
MUCL
46EDV
EXF
CAT1
Eau de Vie
CBS
duur
fermentatie
(u)
93.00
69.00
69.00
93.00
69.00
69.00
133.00
189.00
165.00
189.00
237.00
140.00
133.00
140.00
309.00
fermentatiemedium
Ypgluc pH 4.8
Ypgluc pH 4.8
Ypgluc pH 4.8
Ypgluc pH 4.8
Ypgluc pH 4.8
Ypgluc pH 4.8
sup
sup
sup
sup
sup
sup
sup
sup
sup
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
hydrolysaat
CO2(g)
1.62
1.58
1.59
1.60
1.57
1.63
%EtOH verwacht
(afgeleid van CO2)
2.68
2.62
2.62
2.64
2.59
2.69
%EtOH (v/v)
2.29
2.67
2.70
2.45
2.53
2.59
1.95
2.02
1.95
1.96
1.84
1.90
1.91
1.98
2.02
3.22
3.33
3.22
3.24
3.04
3.13
3.16
3.27
3.34
3.23
3.37
3.31
3.28
3.12
2.95
3.22
3.37
3.36
xylose
over (%)
05022010
viabiliteit (%)
89.90
92.80
73.30
92.20
63.80
74.50
87.50
92.00
78.10
94.10
87.80
93.70
95.20
88.30
75.60
Fermentatie reeks 2
Besluiten
- alle stammen kunnen het hydrolysaat goed fermenteren, maar met duidelijk
verschillende snelheden en enigszins verschillend rendement
- de ethanolproductie is vergelijkbaar met deze van de vorige fermentatie
- de viabiliteit in YPglucose is iets lager dan in de 1° fermentatie, waarschijnlijk
te wijten aan het zuurder medium
- de viabiliteit in hydrolysaat ligt tussen 75 en 95%
Algemene besluiten
- de fermenteerbare suikers vrijgezet door hydrolyse van vlaslemen kunnen
goed gefermenteerd worden
- dit is een indicatie voor geen of weinig inhibitoren in het hydrolysaat
- ook de viabiliteit wijst op weinig inhibitoren
(de lichte daling is waarschijnlijk te wijten aan de lage pH; cfr. de resultaten in
YPglucose pH 4.8)
- verschillende giststammen vertonen verschillende fermentatiesnelheden en
een verschillend rendement; bij meer geconcentreerd hydrolysaat waarschijnlijk
nog meer uitgesproken
- screenen van een grotere collectie stammen zal nodig zijn om één of meer
stammen te vinden die meer geconcentreerd hydrolysaat snel en efficiënt
kunnen fermenteren
- stammen die het goed doen met één substraat doen het niet noodzakelijk
goed met een ander (vergelijk YPglucose aangezuurd tot pH 4.8, met
hydrolysaat)
Verdere proeven
- HPLC op hydrolysaat vóór en na fermentatie -> meer compleet suikerpatroon
- Indien mogelijk, van meer geconcentreerd hydrolysaat vertrekken
-->
> 5% ethanol eindconc.
- Hydrolysaat met YPglucose mengen
--> fermentatie en ethanolproductie vergelijken met
- YPglucose zonder hydrolysaat
- YPglucose met verdund hydrolysaat
Doel: om mogelijke inhiberende werking van het hydrolysaat op de fermentatie
van media met een hoger suikergehalte na te gaan (toevoegen aan eerste
generatie bioethanol substraten mogelijk ?)
05022010
Speciale dank aan
- Thomas Talpe
- Robert Olson, Dieter Depuydt
- Medewerkers van MCB
- IWT